Дэвид Уильям Духовны родился 7 августа 1960 года в Нью-Йорке, США. Его мать Маргарет, эмигрантка из Абердина, Великобритания, преподавала в школе для жителей небогатой части Манхеттена. Отец, Амрам Духовны (1927—2003), уроженец Бруклина, из семьи еврейских иммигрантов, публицист, драматург, автор нескольких книг, в том числе автобиографического романа. Дед со стороны отца, Мойше Духовный (1901—1960), эмигрировал в США из Бердичева Киевской губернии в 1918 году, был журналистом и постоянным сотрудником издающейся в Нью-Йорке на идише ежедневной газеты «Моргн-журнал» (מאָרגן-זשורנאַל — Утренний журнал); бабушка эмигрировала из Польши.
Духовны хорошо учился в школе, поступил в Принстонский университет на факультет педагогики. В молодости решил стать писателем, и, чтобы оплатить своё обучение в университете, подрабатывал доставщиком продуктов, сторожем и барменом. Затем поступил в аспирантуру в Йельском университете, где стал магистром английской литературы и готовился защитить диссертацию на степень кандидата наук (PhD) по теме «Магия и технология в современной поэзии и прозе». Увлёкся театром и стал появляться на сцене во внебродвейских постановках.
Первое появление Духовны на телевидении произошло в 1987 году, когда благодаря своей привлекательной внешности он снялся в рекламе пива Löwenbräu. Вскоре прервал работу над докторской диссертацией и начал брать уроки сценического мастерства. После первого опыта на театральных подмостках почти сразу же попал в Голливуд. В 1988 году дебютировал на большом экране, сыграв эпизодическую роль в фильме Майка Николса «Деловая девушка».
Примерно через год режиссёр Дэвид Линч оценил вкус Духовны к эксцентрике и пригласил его на роль трансвестита — агента службы по борьбе с наркотиками Дени́з Брайсон в трёх эпизодах сериала «Твин Пикс». В этом качестве Духовны понравился Залману Кингу, который пригласил его сыграть роль идеального покинутого любовника-рассказчика в фильме «Дневники Красной Туфельки», а потом и в одноимённом эротическом сериале.
На одном из кинофестивалей работы Духовны привлекли внимание Рэнди Стоуна, продюсера студии 20th Century Fox, который и порекомендовал его Крису Картеру на роль Фокса Малдера. При первой встрече актёр не произвёл впечатления на Картера — его внешность показалась слишком стандартной. Но после первых проб Картер решил, что камера просто «влюблена» в актёра. В 1993 году Духовны стал сниматься в научно-фантастическом сериале «Секретные материалы» в ведущей роли агента ФБР Фокса Малдера, сторонника теории заговора, верящего, что его сестру похитили пришельцы. Снимался в паре с Джиллиан Андерсон, исполнившей роль агента Даны Скалли. Телесериал стал настоящим хитом, принесшим Духовны мировую известность. После семи сезонов и пересмотра контракта Духовны покинул сериал в качестве ведущего актёра, продолжая появляться в отдельных эпизодах.
В 1999 году певица Бри Шарп написала и исполнила песню «David Duchovny». В песне поётся: «Дэвид Духовны, почему ты не хочешь любить меня?», что является как данью уважения к актёру, так и пародией на поклонение знаменитостям в целом. Композиция стала хитом.
Духовны озвучил главных героев компьютерных игр «XIII» и «Area 51».
Начиная с 2007 года Духовны снимался в популярном комедийно-эротическом телесериале «Californication» в роли Хэнка Муди, известного писателя с проблемами в личной жизни. За эту роль в 2008 году получил премию «Золотой глобус» в номинации «Лучший актёр сериала (комедии/мюзикла)».
