Пенелопа Энн Миллер родилась в Лос-Анджелесе. Она средняя дочь режиссёра Марка Миллера и журналистки Беатрис Миллер. Она обучалась в Менло-колледже. В 1985 году Миллер дебютировала в пьесе Нейла Саймона «Билокси-блюз», а в 1988 году снялась в киноверсии постановки.
Миллер номинировалась на премию «Тони» за лучшую женскую роль второго плана в пьесе в постановке 1989 года «Наш городок». После этого она начала свою карьеру на большом экране, где снялась в таких коммерчески успешных фильмах как «Детсадовский полицейский», «Чужие деньги», «Путь Карлито» (роль в котором принесла ей номинацию на «Золотой глобус» за лучшую женскую роль второго плана) и «Тень». Также она сыграла Эдну Пёрвиэнс в фильме 1992 года «Чаплин». В 1997 году она сыграла главную роль в провальном фильме «Реликт», после чего переместилась на телевидение и в низкобюджетные фильмы.
Начиная с конца девяностых, Миллер, в основном, снималась в телефильмах для канала Lifetime, а также исполняла роли второго плана в нескольких недолго просуществовавших ситкомах. В 2011 году она появилась в фильме «Артист», а в 2013 году сыграла второстепенную роль в сериале «Любовницы». В 2014 году, Миллер получила одну из центральных ролей в сериале ABC «Американское преступление». Роль в сериале, в которой Миллер предстала на экране без макияжа и причесок, помогла освежить её увядшую с годами карьеру. Сериал привел её к роли в фильме о расизме «Рождение нации».
В 1995 году Миллер вышла замуж за актёра Уилла Арнетта, с которым в том же году развелась. В 2000 году вышла замуж за Джеймса Хаггинса, но после 12 лет совместной жизни в марте 2012 года актриса подала документы в окружной суд Лос-Анджелеса на развод и раздел имущества. От этого брака у актрисы есть две дочери (2000 и 2009 года рождения).